Problémy s udržováním životaschopnosti buněk v systému zobrazování živých buněk během zobrazování

Zobrazování živých buněk je důležitým analytickým nástrojem v laboratořích studujících biomedicínské výzkumné obory, jako je buněčná biologie, neurobiologie, farmakologie a vývojová biologie. Zobrazení fixovaných buněk a tkání (pro které je hlavním problémem fotobělení) obvykle vyžaduje vysokou intenzitu osvětlení a dlouhou dobu expozice; těm je však třeba se při zobrazování živých buněk vyhnout. Mikroskopie živých buněk obvykle zahrnuje kompromis mezi získáním kvality obrazu a udržením zdravých buněk. Aby se předešlo vysoké intenzitě osvětlení a dlouhé době expozice, jsou prostorová a časová rozlišení v experimentu často omezena. Zobrazování živých buněk zahrnuje širokou škálu kontrastních zobrazovacích metod pro optickou mikroskopii. Většina výzkumů používá jeden z mnoha typů fluorescenční mikroskopie, a to je často kombinováno s technikami procházejícího světla, které budou diskutovány níže. Neustálé pokroky v zobrazovacích technikách a designu fluorescenčních sond zlepšují sílu tohoto přístupu a zajišťují, že zobrazování živých buněk bude i nadále důležitým nástrojem v biologii.

Důležitou opatrností je zajistit, aby buňky byly v dobrém stavu a fungovaly normálně, když jsou na stolku mikroskopu s osvětlením v přítomnosti syntetických fluoroforů nebo fluorescenčních proteinů. Podmínky, za kterých jsou buňky udržovány na mikroskopu, i když jsou velmi variabilní, často určují úspěch nebo neúspěch experimentu.

K dispozici jsou různá buněčná kultivační média na základě konkrétních biochemických požadavků buněk. Kultivační média obsahují různé složky, včetně aminokyselin, vitamínů, anorganických solí (minerály), stopových prvků, složek nukleových kyselin (bází a nukleosidů), cukrů, meziproduktů cyklu trikarboxylových kyselin, lipidů a koenzymů. V médiích pro tkáňové kultury je důležitým krokem kontrola koncentrace kyslíku, pH, pufrační kapacity, osmolarity, viskozity a povrchového napětí. Komerčně dostupné formulace médií často obsahují indikátorové barvivo (např. fenolovou červeň) pro vizuální stanovení přibližné hodnoty pH. Téměř všechny buněčné linie potřebují pufrovací systém s oxidem uhličitým a hydrogenuhličitanem pro regulaci pH. Buňky je třeba kultivovat v atmosféře, která obsahuje malé množství oxidu uhličitého (obvykle 5–7 %) v inkubátorech, aby se kontrolovala koncentrace rozpuštěného plynu. Pro zobrazování živých buněk může být obtížné zajistit vhodnou atmosféru s oxidem uhličitým, a to obvykle vyžaduje speciálně navržené kultivační komory pro regulovanou atmosféru. Požadavky na kyslík se mohou u jednotlivých buněčných linií lišit, ale pro většinu kultur jsou vhodné normální hladiny atmosférického kyslíku. Co se týče osmolarity, většina buněčných linií má velkou toleranci k osmotickému tlaku, s dobrým růstem při osmolaritách mezi 260 a 320 miliosmolárními. Když jsou buňky pěstovány v kulturách na otevřených plotnách nebo Petriho miskách, lze použít hypotonické médium, aby se vyrovnalo s odpařováním.